自PCR技術誕生以來已經有三十年了，從經典PCR、實時定量PCR再到現(xiàn)在的數(shù)字PCR，這一技術在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。很多人的實驗根本離不開PCR。筆者曾經也接觸PCR很長一段時間，加樣、設置程序、等待、檢測。這些過程看起來容易，但實驗結果卻總是會出人意料，很多時候根本不知道是哪里出了錯。那么要是有一款技術，它比PCR更快速、便捷、，你會感興趣嗎？

RPA是什么？

基本原理

重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。RPA技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，zui適反應溫度在37°C左右。

重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發(fā)生鏈交換反應形成并啟動DNA合成，對模板上的目標區(qū)域進行指數(shù)式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非?？欤话憧稍谑昼娭畠全@得可檢出水平的擴增產物。

圖片來源：Isothermal amplified detection of DNA and RNA

引物設計

RPA分析的關鍵在于擴增引物和探針的設計。PCR引物多半是不適用的，因為RPA引物比一般PCR引物長，通常需要達到30-38個堿基。引物過短會降低重組率，影響擴增速度和檢測靈敏度。在設計RPA引物時，變性溫度不再是影響擴增引物的關鍵因素。RPA的引物和探針設計不像傳統(tǒng)PCR那樣成熟，用戶需要自己摸條件進行優(yōu)化。

優(yōu)勢

常規(guī)PCR必須經過變性、退火、延伸三個步驟，而PCR儀本質上就是一個控制溫度升降的設備。RPA反應的zui適溫度在37℃-42℃之間，無需變性，在常溫下即可進行。這無疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要溫控設備，RPA可以真正實現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測。

據介紹，RPA檢測的靈敏度很高，能夠將痕量的核酸（尤其是DNA）模板擴增到可以檢出的水平，從單個模板分子得到大約1012擴增產物。而且RPA還用不著復雜的樣品處理，適用于無法提取核酸的實地檢測。

RPA既可以擴增DNA也可以擴增RNA，還省去了額外的cDNA合成步驟。你不僅可以對擴增產物進行終點檢測，還可以對擴增過程進行實時監(jiān)控，甚至可以通過試紙條（側流層析試紙條LFD）讀取結果。

RPA可以用來干什么？

RPA對硬件設備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農業(yè)等領域。以下為大家介紹RPA在細菌、病毒檢測以及癌癥研究等領域的應用情況。

RPA成為致病菌檢測的得力工具

在今年發(fā)表的一系列文章中，RPA技術被廣泛用于艱難梭狀芽孢桿菌、結核桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA、淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）、沙門氏菌、大腸埃希菌STEC等常見致病菌的檢測。在臨床診斷和食品安全方面，為人們提供了簡單快速的實地篩查方案。（這篇文獻之前報道過，在這里就不詳述了。）[詳細]

RPA技術建立沙眼衣原體快速檢測方法

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis）感染是zui常見的性傳播疾病之一。沙眼衣原體影響5-10%的人口，常見于小于25歲的成年人。目前廣泛使用的沙眼衣原體檢測方法是以聚合酶鏈反應（PCR）技術為基礎，這種方法只適合于經過專業(yè)訓練的人員在具有特定儀器的實驗室使用。

日前，發(fā)表在《分子診斷雜志》（The Journal of Molecular Diagnostics）雜志上的一項研究中，研究人員利用RPA技術開發(fā)了一種檢測沙眼衣原體的快速、靈敏的新方法，利用該方法在20分鐘內即可得出檢測結果。[參考文獻]

研究人員利用RPA技術直接從患者尿液樣本中檢測沙眼衣原體，不需要從尿液樣品提取總DNA，也不需要專門的儀器設備。而且該檢測方法還具有少費力、少耗時、更經濟等特點。與目前的沙眼衣原體檢測方法比較而言，該方法還能夠顯著提高檢測的敏感性和特異性

RPA檢測瘧原蟲

澳大利亞科學家捕捉到瘧原蟲入侵并摧毀人體紅細胞畫面

核酸擴增是目前zui靈敏的瘧原蟲（P. falciparum）特異性檢測法。然而，PCR需要熱循環(huán)設備和專業(yè)性操作，資源匱乏的地區(qū)往往難以滿足這些條件。在這種情況下，與側流層析結合的RPA有著很大的應用前景。

《Malaria Journal》雜志今年三月份發(fā)表的一項研究中，研究人員將RPA基礎反應、TwistAmp nfo探針和側流層析結合起來，實現(xiàn)了瘧原蟲18S rRNA基因的高靈敏度快速檢測。在38°C的條件下，只需要不到十分鐘的擴增，就能檢出含有四個瘧原蟲的樣本。加上側流層析的檢測時間，整個流程總共只需要15分鐘，而且肉眼可以直接看到檢測結果。

研究人員用不同瘧原蟲測試了這種方法的靈敏度和特異性。研究顯示，所有瘧原蟲都被成功檢出，所有非瘧原蟲都得出了陰性結果。文章指出，這一方案將大大改善資源匱乏地區(qū)的瘧原蟲分子診斷。[參考文獻]

RPA檢測冠狀病毒

2012年在中東鑒定的中東呼吸綜合癥冠狀病毒( Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)是一種新型的冠狀病毒。這種病毒很快傳入了歐洲，給公共安全機構敲響了警鐘。

目前，MERS-CoV檢測主要依賴于實時RT-PCR，需要收集患者樣本然后到專門的實驗室去檢驗。因此，亟需能夠進行實地檢測的快速裝置。

《PLOS Currents：Outbreaks》去年十二月發(fā)表的一項研究，開發(fā)了一個能在3-7分鐘內鑒定MERS-CoV的便攜式RT-RPA裝置。在42°C條件下，等溫MERS-CoV RT-RPA與實時RT-PCR一樣敏感，可檢出10個RNA分子。文章指出，這個便攜裝置是監(jiān)控MERS-CoV傳播，尋找其動物宿主的理想方法。[參考文獻]

RPA檢測埃博拉等十種致命威脅

檢測傳染性疾病的綜合panel，有助于資源匱乏地區(qū)進行實地分子診斷，對生物防御工作也有很大的幫助。

《Journal of Clinical Microbiology》雜志去年四月的一項研究開發(fā)了一個RPA檢測panel，對土拉弗朗西斯氏菌（Francisella tularensis）、鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis）、炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）、天花病毒進行RPA分析，對裂谷熱病毒（Rift Valley fever virus）、埃博拉病毒、Sudan病毒和馬爾堡病毒進行RT-RPA分析。研究顯示，這些RPA和RT-RPA的分析靈敏度大多在16-21個分子之間（與實時PCR相當），42°C下只需運行6-10分鐘，而且不存在交叉反應。[參考文獻]

RPA檢測HIV

在HIV診治中，即時檢測是非常重要的，對嬰兒來說更是如此。有案例顯示，HIV感染后立刻進行治療就能控制住患者體內的病毒，讓它們無法進行復制。舉例來說，生來就攜帶HIV的密西西比嬰兒，在出生后立即得到了治療。后來這個孩子停藥了兩年多，病毒復制依然得到了控制。

目前嬰兒HIV診斷的金標方法是DNA PCR，但許多地區(qū)并不具備這樣的條件。在這種條件下，RPA技術正好可以大展身手。（四篇論文介紹了RPA在HIV檢測中的應用）[詳細]

RPA在癌癥研究中的應用

去年六月，新加坡A*STAR的研究團隊在Lab on a Chip雜志上，發(fā)表了一種能夠快速檢測癌癥單點突變的新技術，等溫固相擴增/檢測（ISAD）。這是一種無需標記的實時檢測技術，將基于硅基微環(huán)（silicon microring）的固相擴增與等溫重組酶聚合酶擴增（RPA）結合在一起。

去年十月，Talanta雜志上也發(fā)表了一項用到RPA技術的癌癥研究。該研究在超靈敏生物條碼分析（BBC）、適配體（aptamer）和RPA的基礎上，開發(fā)了一個檢測細胞色素C（Cyto-c）的新生物條碼分析法（ABC）。細胞色素C是細胞死亡的重要標志物。（點擊鏈接查看這兩項研究的詳細報道和文獻）[詳細]

RPA全攻略之疑難解答

說了這么多，你們肯定會有很多疑問，引物怎么設計？RPA反應能實現(xiàn)多重化么?RPA反應能對模板進行定量么? RPA支持生物素或熒光標記的寡核苷酸么? RPA支持生物素或熒光標記的寡核苷酸么?以下就為大家一一解答。

RPA的擴增引物可以說是整個反應的關鍵所在，那么怎樣才能設計好RPA引物呢？引物長度怎樣選擇？引物序列有什么要求？擴增產物長度有何限制？篩選的主要流程？答案詳見《RPA：引物與探針的常見問題》一文。此外，在該文中你還可以找到以下問題的答案。

可以。RPA在同一個管中同時進行多個擴增反應。不過，多重化的引物組合需要精心設計，以便每個引物都能同樣有效的工作。需要注意的是，RPA反應的引物總量(nmol)不要超標太多。如果在一個反應中使用兩個以上的擴增引物，就應該控制不同引物的量。另外，我們應當事先考慮好檢測多個擴增事件的探針、設備以及熒光團的兼容性。

可以。擴增子達到可檢出水平的時間，依賴于反應起始時的模板量。初始模板的拷貝越多，擴增子就越快達到可檢出水平。不過，這種定量需要精心的實驗安排，確保對照反應是同時開始的。舉例來說，可以利用鎂離子的添加時間進行控制。因為鎂離子一旦進入體系，RPA反應就會開始。

此外，較慢的擴增過程有助于更的定量。我們可以通過調整反應條件或引物設計來減慢RPA的反應速度。

可以。這樣比較的是反應開始時的熒光和反應結束時的熒光，熒光增強意味著發(fā)生了擴增。

支持。在RPA反應中，連有生物素或熒光團的引物與未修飾的引物表現(xiàn)差不多。據悉還沒有發(fā)現(xiàn)任何差異。

可以。插入性染料可以在RPA反應中進行定量和監(jiān)控。不過，這種染料可以結合任何雙鏈DNA，會生成來自引物的假陽性信號。由于RPA擴增在常溫下進行，這種噪音會比PCR嚴重一些。

需要。RPA反應中的物質會干擾瓊脂糖電泳，如果不進行產物回收，跑出來的帶會出現(xiàn)拖尾。

小編寄語

小編其實對PCR還是蠻有陰影的，之前很多做分子生物學的朋友經常說的一句就是：“怎么又沒P出來！"PCR好像“承包"了核酸檢測似的。雖然小編現(xiàn)在不用做實驗室了，但是還是希望新技術可以對在科研一線的你們有幫助。